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第一单元 基因工程
【重难点突破】
一、如何理解基因工程的概念和原理
1、操作环境是生物体外，典型过程是基因表达载体的构建。
2、基因工程的优点
（1）克服了远缘杂交不亲和的障碍。基因工程和植物体细胞杂交一样，突破了有性生殖的局限。
（2）定向改造了生物性状。与诱变育种相比较克服了诱变育种的突变的不定向性。
3、原理是基因重组。
4、操作层次：是分子水平。是获取某生物的DNA分子片段，把它与另一个DNA分子片段结合成一个DNA分子。
5、实质：A种生物的某个基因通过一定方式导入B种生物体内并能进行基因表达。基因没有改变，蛋白质没有改变，只是转录和翻译吃场所发生改变。
6、目的基因和载体能够形成重组DNA分子的基础是
（1）物质组成相同，都是四种脱氧核苷酸组成。
（2）空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
（3）结构和功能单位相同，基因是控制生物性状的结构和功能单位。性状都是蛋白质表现的。
（4）遵循的基因表达原则相同，基因表达包括了基因的复制，转录和翻译，都遵循中心法则。
（5）遗传密码相同，所有生物共用一套遗传密码。
【典题演示】
1、（2011温州十校）采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是（ ）
A．如果人凝血因子基因的核苷酸序列已知，可用人工合成的方法获得该目的基因
B．人体细胞中凝血因子基因进入羊受精卵细胞后，其传递和表达不再遵循中心法则
C．在该转基因羊体内，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D．人凝血因子基因开始转录后，DNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【答案】A
【解析】掌握基因工程的原理是突破口。当已知某种基因的核苷酸序列，可以进行人工合成；目的基因的表达仍然遵循中心法则；由于目的基因是导入受精卵，所有体细胞都含有目的基因，只有在乳腺细胞中表达，是因为目的基因连接了乳蛋白的基因的启动子；转录需要的酶是RNA聚合酶。
【变式训练1】
1、（2010临沂一模）转基因植物是通过基因工程拥有其他物种基因即外源基因的植物。下列有关叙述中，正确的是（ ）
A．外源基因就是目的基因
B．外源基因的遗传都遵循孟德尔遗传定律
C．基因工程中的运载体质粒是细胞核内能够复制的DNA分子
D．通过基因工程，植物细胞也能合成某些细菌的蛋白质
【答案】D
【解析】掌握目的基因和外源基因的关系是突破口。把插入到载体内的那个特定的片段基因称为外源基因，而将那些已被或者准备要被分离，表达的特定基因称为目的基因。外源基因针对受体生物而言是受体生物不具有的基因，目的基因是针对人的需要而言。外源基因如果存在线粒体、叶绿体、质粒或者原核细胞的DNA上是不遵循孟德尔的遗传规律的；质粒是存在细胞质的环状DNA；棉花的抗虫基因的表达证明植物细胞也能合成某些细菌的蛋白质。
【变式训练2】、（2010苏北四市三模）下列过程一定能够导致DNA分子结构发生改变的是
A．基因工程 B．DNA分子扩增 C．染色体变异 D．交叉互换
【答案】A
【解析】正确掌握影响DNA分子结构的因素和方式是突破口。DNA分子扩增是以DNA分子作为单位，进行半保留复制增加DNA分子数目；染色体的变异和交叉互换是发生在基因数量或者位置的改变，并没有影响DNA分子内部；只有基因工程是在一个DNA分子内部插入了另外一个DNA分子的片段。
【变式训练3】、（2010苏州中学）（多选）下列关于基因工程的叙述，正确的是
A.目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物
B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原有生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【答案】AB
二、基因工程操作常用的工具有哪些？
1、限制酶又称限制性核酸内切酶
（1）化学本质 ：蛋白质
（2）来源：主要来源于原核生物，是原核生物切断入侵细胞内外源DNA的保护自身的工具。
（3）作用：具有酶的共性催化作用外还用于对DNA分子的切割获取目的基因和对载体的切割。
（4）特异性，能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并有特定的切割位点。切割的化学键叫磷酸二酯键。
切割目的基因和载体时要用同一中限制酶。
（5）切割的结果有两种分别是粘性末端和平末端。
2、DNA连接酶
（1）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用：是连接两个DNA片段形成磷酸二酯键。
（3）适用对象：E.coliDNA连接酶是连接粘性末端，T4DNA连接酶是连接粘性末端和平末端。
（4）与DNA聚合酶的比较：相同点都可以形成磷酸二酯键；不同点是DNA连接酶是连接DNA片段形成重组DNA分子，DNA聚合酶是把游离的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，连接在一条脱氧核苷酸链上形成新的DNA分子。
3、载体
（1）常用载体是质粒，本质是小型环状DNA；其他载体有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
（2）功能：将目的基因导入受体细胞。
（3）载体必需具备的条件：能够在宿主细胞内稳定保存并大量复制；有一个至多个限制酶的切割位点，以便于与外源基因进行连接；有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的检测和鉴定。
（4）特别注意：①现在使用的载体多是人工改造的；②常见的标记基因有抗生素抗性基因、发光基因和产生特点颜色的表达产物基因等；③质粒可以在自身细胞、受体细胞或者体外环境都可以进行自我复制；④载体上最好是每种酶的切点只有一个；⑤细胞膜上的载体是蛋白质，具有运输作用。
【典题演示2】
1、 (2010无锡高三)基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是?C↓GATCC?限制酶Ⅱ的识别序列和切点是?↓GATC?。根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒用限制酶I切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
D.质粒用限制酶I切割，甘的基因用限制酶Ⅱ切割
【变式训练4】
1、下列有关DNA聚合酶链式反应的说法正确的是（ ）
A．需要引物 B．始终在高于70℃的条件下进行
C．需要加DNA连接酶 D．需要加热稳定DNA聚合酶
【变式训练5】、已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是
A.3 B.4 C.9 D.12
【变式训练6】、2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是
A．追踪目的基因在细胞内的复制过程
B．追踪目的基因插入到染色体上的位置
C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布
D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
三 基因工程的操作程序有哪些？
1、目的基因的获取
技术：限制酶切割?切割出粘性末端和平末端。
（1）从基因文库中获取目的基因；
文库类型cDNA文库基因组文库
文库大小小大
基因中的启动子无有
基因的多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因
物种之间的基因交流可以部分基因可以
说明基因文库的组建过程包含了基因工程的操作过程。从基因文库获取目的基因的优点是操作简便；缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
（2）利用PCR技术扩增目的基因；
PCR技术DNA复制
相
同
点原理DNA复制（碱基互补配对原则）
原料四种游离脱氧核苷酸
条件模板、ATP、酶、原料、引物
不
同
点解旋方式DNA在高温下解旋解旋酶催化
场所体外复制主要在细胞核内
酶Taq酶细胞内的DNA聚合酶
结果短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子
（3）人工合成。常见的有反转录法和氨基酸序列合成法两种。
①反转录法 是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。
②氨基酸序列合成法是建立在DNA序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，现在用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且必须事先把它们的核苷酸序列搞清楚。对于许多复杂的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用这种方法合成，只能用前两种方法或其他方法分离或合成。这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类需求。因此，这一方法今后将随着技术的不断改进而得到越来越广泛的应用。
2、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（1）基因表达载体的结构组成：
启动子是启动转录的DNA片段；终止子是终止转录的DNA片段；目的基因；抗生素抗性基因是标记基因；复制原点DNA的复制有特定的起始位点。
（2）技术：应用DNA连接酶连接末端。
3、将目的基因导入受体细胞
（1）导入双子叶植物一般用农杆菌转化法；农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。
我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
（2）棉花用花粉管通道法；亦称受粉后外源基因导入植物的技术，是利用植物受粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织），经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似"原生质体"状态，并且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合进受体基因组中，以达遗传转化的目的。
在双受精过程完成后，受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。此时期的细胞尚不具备完整垢细胞壁和核膜系统，细胞内外的物质交流频繁。通过花粉管通道途径渗透进入胚囊的转基因片段就有可能被吸入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进入受体基因组中。
（3）单子叶植物基因枪法；
（4）导入动物细胞用显微注射法；在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为10％。
（5）导入微生物细胞，用Ca2+处理成为感受态细胞。在CaCl2溶液中，细菌细胞会发生膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞
同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。
总的来说就是细胞在低温Ca2+等因子诱导下,细胞膜通透性发生改变,膜通透性的改变使细胞可以摄取DNA。
（2）特点：四个步骤中唯一不涉及碱基互补配对的。选用微生物作为受体细胞的理由是个体微小，代谢旺盛，繁殖速度快，获得的目的基因产物多。
4、目的基因的检测和鉴定
（1）分子水平的检测：利用DNA分子杂交法检测目的基因及其产物mRN；用抗原?抗体杂交检验目的基因的蛋白质产物；检测结果看是否出现杂交带。
（2）个体水平检测。
【典题演示3】
1、（2010浙江）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（ ）
A.用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸
B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C.将重组DNA分子导入原生质体
D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
【答案】A
【解析】本题考查基因工程的有关知识，基因工程的一般过程：①用限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA分子（除草剂基因）和运载体（质粒），②用DNA连接酶连接切割好的目的基因和运载体③重组DNA分子导入受体细胞，因为是植物可以说是原生质体④用相应的试剂和病原体帅选转基因细胞⑤用植物组织培养技术抗除草剂的转基因烟草（表达）。
【变式训练7】
1、（2010江苏）下列关于转基因植物的叙述。正确的是
A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传人环境中
B．转抗虫基因的植物．不会导致昆虫群体抗性基因撷宰增加
C．动物的生长激素基因转人植物后不能表达
D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
【答案】A
【解析】本题考查了转基因技术的安全性问题。转入到油菜的基因，可以通过花粉传入环境中；由于植物与害虫间是相互选择的，转抗虫基因植物可使昆虫群体抗性基因频率增加；动物生长素基因转入植物后也能表达；转基因技术的安全性问题，要通过验证才能得到证实。
【变式训练8】、（2009上海理综）科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是
A．基因自由组合定律 B．半保留复制原则
C．基因分离定律 D．碱基互补配对原则
【答案】D
【解析】本题考查基因工程的相关知识，重组质粒依据的是粘性末端的碱基互补配对原则。
【变式训练9】、（2009广东理基）钱永健先生因在研究绿色荧光蛋白方面的杰出成就而获2008年诺贝尔奖。在某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光。由此可知
A．该生物的基因型是杂合的
B．该生物与水母有很近的亲缘关系
C．绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达
D．改变绿色荧光蛋白基因的1个核苷酸对，就不能检测到绿色荧光
【答案】C
【解析】某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光，说明绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达。
四、基因工程和蛋白质工程有哪些实际应用？
1、转基因植物：
（1）抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因。
（2）抗病转基因植物：抗病毒植物使用最多的病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因；抗真菌转基因使用几丁质酶基因和抗毒素合成基因。
（3）其他抗逆转基因植物 导入调节渗透压的基因；鱼的抗冻蛋白基因；抗除草剂基因。
2、转基因动物
（1）导入外源生长素基因可以提高动物生长速度
（2）导入肠乳糖酶基因，改善奶牛的牛奶品质
（3）导入血清白蛋白等基因可以用转基因动物生产药物
（4）用转基因动物作器官移植的供体
3、蛋白质工程
【典题演示4】
（2010全国2）下列叙述符合基因工程概念的是
A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
【答案】B
【解析】 B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因属于动物细胞工程的内容；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
属于微生物的发酵工程的内容；自然状态下，一般不能自行形成重组DNA分子。
【总结提升】
两种工具酶，三种工具，四步操作。
第一单元 基因工程
【重难点突破】
一、如何理解基因工程的概念和原理
1、操作环境是生物体外，典型过程是基因表达载体的构建。
2、基因工程的优点
（1）克服了远缘杂交不亲和的障碍。基因工程和植物体细胞杂交一样，突破了有性生殖的局限。
（2）定向改造了生物性状。与诱变育种相比较克服了诱变育种的突变的不定向性。
3、原理是基因重组。
4、操作层次：是分子水平。是获取某生物的DNA分子片段，把它与另一个DNA分子片段结合成一个DNA分子。
5、实质：A种生物的某个基因通过一定方式导入B种生物体内并能进行基因表达。基因没有改变，蛋白质没有改变，只是转录和翻译吃场所发生改变。
6、目的基因和载体能够形成重组DNA分子的基础是
（1）物质组成相同，都是四种脱氧核苷酸组成。
（2）空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
（3）结构和功能单位相同，基因是控制生物性状的结构和功能单位。性状都是蛋白质表现的。
（4）遵循的基因表达原则相同，基因表达包括了基因的复制，转录和翻译，都遵循中心法则。
（5）遗传密码相同，所有生物共用一套遗传密码。
【典题演示】
1、（2011温州十校）采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是（ ）
A．如果人凝血因子基因的核苷酸序列已知，可用人工合成的方法获得该目的基因
B．人体细胞中凝血因子基因进入羊受精卵细胞后，其传递和表达不再遵循中心法则
C．在该转基因羊体内，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D．人凝血因子基因开始转录后，DNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【答案】A
【解析】掌握基因工程的原理是突破口。当已知某种基因的核苷酸序列，可以进行人工合成；目的基因的表达仍然遵循中心法则；由于目的基因是导入受精卵，所有体细胞都含有目的基因，只有在乳腺细胞中表达，是因为目的基因连接了乳蛋白的基因的启动子；转录需要的酶是RNA聚合酶。
【变式训练1】
1、（2010临沂一模）转基因植物是通过基因工程拥有其他物种基因即外源基因的植物。下列有关叙述中，正确的是（ ）
A．外源基因就是目的基因
B．外源基因的遗传都遵循孟德尔遗传定律
C．基因工程中的运载体质粒是细胞核内能够复制的DNA分子
D．通过基因工程，植物细胞也能合成某些细菌的蛋白质
【答案】D
【解析】掌握目的基因和外源基因的关系是突破口。把插入到载体内的那个特定的片段基因称为外源基因，而将那些已被或者准备要被分离，表达的特定基因称为目的基因。外源基因针对受体生物而言是受体生物不具有的基因，目的基因是针对人的需要而言。外源基因如果存在线粒体、叶绿体、质粒或者原核细胞的DNA上是不遵循孟德尔的遗传规律的；质粒是存在细胞质的环状DNA；棉花的抗虫基因的表达证明植物细胞也能合成某些细菌的蛋白质。
【变式训练2】、（2010苏北四市三模）下列过程一定能够导致DNA分子结构发生改变的是
A．基因工程 B．DNA分子扩增 C．染色体变异 D．交叉互换
【答案】A
【解析】正确掌握影响DNA分子结构的因素和方式是突破口。DNA分子扩增是以DNA分子作为单位，进行半保留复制增加DNA分子数目；染色体的变异和交叉互换是发生在基因数量或者位置的改变，并没有影响DNA分子内部；只有基因工程是在一个DNA分子内部插入了另外一个DNA分子的片段。
【变式训练3】、（2010苏州中学）（多选）下列关于基因工程的叙述，正确的是
A.目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物
B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原有生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【答案】AB
二、基因工程操作常用的工具有哪些？
1、限制酶又称限制性核酸内切酶
（1）化学本质 ：蛋白质
（2）来源：主要来源于原核生物，是原核生物切断入侵细胞内外源DNA的保护自身的工具。
（3）作用：具有酶的共性催化作用外还用于对DNA分子的切割获取目的基因和对载体的切割。
（4）特异性，能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并有特定的切割位点。切割的化学键叫磷酸二酯键。
切割目的基因和载体时要用同一中限制酶。
（5）切割的结果有两种分别是粘性末端和平末端。
2、DNA连接酶
（1）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用：是连接两个DNA片段形成磷酸二酯键。
（3）适用对象：E.coliDNA连接酶是连接粘性末端，T4DNA连接酶是连接粘性末端和平末端。
（4）与DNA聚合酶的比较：相同点都可以形成磷酸二酯键；不同点是DNA连接酶是连接DNA片段形成重组DNA分子，DNA聚合酶是把游离的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，连接在一条脱氧核苷酸链上形成新的DNA分子。
3、载体
（1）常用载体是质粒，本质是小型环状DNA；其他载体有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
（2）功能：将目的基因导入受体细胞。
（3）载体必需具备的条件：能够在宿主细胞内稳定保存并大量复制；有一个至多个限制酶的切割位点，以便于与外源基因进行连接；有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的检测和鉴定。
（4）特别注意：①现在使用的载体多是人工改造的；②常见的标记基因有抗生素抗性基因、发光基因和产生特点颜色的表达产物基因等；③质粒可以在自身细胞、受体细胞或者体外环境都可以进行自我复制；④载体上最好是每种酶的切点只有一个；⑤细胞膜上的载体是蛋白质，具有运输作用。
【典题演示2】
1、 (2010无锡高三)基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是?C↓GATCC?限制酶Ⅱ的识别序列和切点是?↓GATC?。根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒用限制酶I切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
D.质粒用限制酶I切割，甘的基因用限制酶Ⅱ切割
【变式训练4】
1、下列有关DNA聚合酶链式反应的说法正确的是（ ）
A．需要引物 B．始终在高于70℃的条件下进行
C．需要加DNA连接酶 D．需要加热稳定DNA聚合酶
【变式训练5】、已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是
A.3 B.4 C.9 D.12
【变式训练6】、2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是
A．追踪目的基因在细胞内的复制过程
B．追踪目的基因插入到染色体上的位置
C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布
D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
三 基因工程的操作程序有哪些？
1、目的基因的获取
技术：限制酶切割?切割出粘性末端和平末端。
（1）从基因文库中获取目的基因；
文库类型cDNA文库基因组文库
文库大小小大
基因中的启动子无有
基因的多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因
物种之间的基因交流可以部分基因可以
说明基因文库的组建过程包含了基因工程的操作过程。从基因文库获取目的基因的优点是操作简便；缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
（2）利用PCR技术扩增目的基因；
PCR技术DNA复制
相
同
点原理DNA复制（碱基互补配对原则）
原料四种游离脱氧核苷酸
条件模板、ATP、酶、原料、引物
不
同
点解旋方式DNA在高温下解旋解旋酶催化
场所体外复制主要在细胞核内
酶Taq酶细胞内的DNA聚合酶
结果短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子
（3）人工合成。常见的有反转录法和氨基酸序列合成法两种。
①反转录法 是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。
②氨基酸序列合成法是建立在DNA序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，现在用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且必须事先把它们的核苷酸序列搞清楚。对于许多复杂的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用这种方法合成，只能用前两种方法或其他方法分离或合成。这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类需求。因此，这一方法今后将随着技术的不断改进而得到越来越广泛的应用。
2、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（1）基因表达载体的结构组成：
启动子是启动转录的DNA片段；终止子是终止转录的DNA片段；目的基因；抗生素抗性基因是标记基因；复制原点DNA的复制有特定的起始位点。
（2）技术：应用DNA连接酶连接末端。
3、将目的基因导入受体细胞
（1）导入双子叶植物一般用农杆菌转化法；农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。
我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
（2）棉花用花粉管通道法；亦称受粉后外源基因导入植物的技术，是利用植物受粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织），经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似"原生质体"状态，并且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合进受体基因组中，以达遗传转化的目的。
在双受精过程完成后，受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。此时期的细胞尚不具备完整垢细胞壁和核膜系统，细胞内外的物质交流频繁。通过花粉管通道途径渗透进入胚囊的转基因片段就有可能被吸入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进入受体基因组中。
（3）单子叶植物基因枪法；
（4）导入动物细胞用显微注射法；在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为10％。
（5）导入微生物细胞，用Ca2+处理成为感受态细胞。在CaCl2溶液中，细菌细胞会发生膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞
同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。
总的来说就是细胞在低温Ca2+等因子诱导下,细胞膜通透性发生改变,膜通透性的改变使细胞可以摄取DNA。
（2）特点：四个步骤中唯一不涉及碱基互补配对的。选用微生物作为受体细胞的理由是个体微小，代谢旺盛，繁殖速度快，获得的目的基因产物多。
4、目的基因的检测和鉴定
（1）分子水平的检测：利用DNA分子杂交法检测目的基因及其产物mRN；用抗原?抗体杂交检验目的基因的蛋白质产物；检测结果看是否出现杂交带。
（2）个体水平检测。
【典题演示3】
1、（2010浙江）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（ ）
A.用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸
B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C.将重组DNA分子导入原生质体
D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
【答案】A
【解析】本题考查基因工程的有关知识，基因工程的一般过程：①用限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA分子（除草剂基因）和运载体（质粒），②用DNA连接酶连接切割好的目的基因和运载体③重组DNA分子导入受体细胞，因为是植物可以说是原生质体④用相应的试剂和病原体帅选转基因细胞⑤用植物组织培养技术抗除草剂的转基因烟草（表达）。
【变式训练7】
1、（2010江苏）下列关于转基因植物的叙述。正确的是
A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传人环境中
B．转抗虫基因的植物．不会导致昆虫群体抗性基因撷宰增加
C．动物的生长激素基因转人植物后不能表达
D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
【答案】A
【解析】本题考查了转基因技术的安全性问题。转入到油菜的基因，可以通过花粉传入环境中；由于植物与害虫间是相互选择的，转抗虫基因植物可使昆虫群体抗性基因频率增加；动物生长素基因转入植物后也能表达；转基因技术的安全性问题，要通过验证才能得到证实。
【变式训练8】、（2009上海理综）科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是
A．基因自由组合定律 B．半保留复制原则
C．基因分离定律 D．碱基互补配对原则
【答案】D
【解析】本题考查基因工程的相关知识，重组质粒依据的是粘性末端的碱基互补配对原则。
【变式训练9】、（2009广东理基）钱永健先生因在研究绿色荧光蛋白方面的杰出成就而获2008年诺贝尔奖。在某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光。由此可知
A．该生物的基因型是杂合的
B．该生物与水母有很近的亲缘关系
C．绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达
D．改变绿色荧光蛋白基因的1个核苷酸对，就不能检测到绿色荧光
【答案】C
【解析】某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光，说明绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达。
四、基因工程和蛋白质工程有哪些实际应用？
1、转基因植物：
（1）抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因。
（2）抗病转基因植物：抗病毒植物使用最多的病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因；抗真菌转基因使用几丁质酶基因和抗毒素合成基因。
（3）其他抗逆转基因植物 导入调节渗透压的基因；鱼的抗冻蛋白基因；抗除草剂基因。
2、转基因动物
（1）导入外源生长素基因可以提高动物生长速度
（2）导入肠乳糖酶基因，改善奶牛的牛奶品质
（3）导入血清白蛋白等基因可以用转基因动物生产药物
（4）用转基因动物作器官移植的供体
3、蛋白质工程
【典题演示4】
（2010全国2）下列叙述符合基因工程概念的是
A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
【答案】B
【解析】 B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因属于动物细胞工程的内容；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
属于微生物的发酵工程的内容；自然状态下，一般不能自行形成重组DNA分子。
【总结提升】
两种工具酶，三种工具，四步操作。
