6.2 DNA片段的扩增――PRC技术
★课题目标(一)知识与技能1、了解pcr技术的基本操作2、理解pcr的原理3、讨论pcr的应用
(二)过程与方法
在多聚酶链式反应扩增dna片段的实验过程中,应避免外源dna污染,严格控制温度等反应条件(三)情感、态度与价值观 通过对pcr实验的操作及结果分析,培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神★课题重点pcr的原理和pcr的基本操作★课题难点 pcr的原理★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件★教学过程 (一)引入新课在现代生物技术中,dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列,就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢?今天我们来研究学习dna分子的扩增技术 pcr技术。(二)进行新课1.基础知识pcr技术扩增dna的过程,与细胞内dna复制过程类似:1.1细胞内dna复制条件分析:条件组分作用模板dna的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成dna子链的原料酶解旋酶dna聚合酶打开dna双螺旋催化合成dna子链能量atp为解螺旋和合成子链供能引物rna为dna聚合酶提供合成的3’端起点1.2细胞内dna复制过程(1)dna的反向平行结构:(结合教材图5-6)核苷酸分子的结构与方向性:(分子结构模式图)由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链:(模式图,体现方向性)。dna双螺旋结构的反向平行结构:(2)dna的复制过程:解 旋:解旋酶、atp,dna两条链打开,,形成两条dna单链。引物结合:在dna单链3’端与dna反向配对结合,确保引物3’端与dna单链准确配对。dna聚合酶结合:子链合成:dna聚合酶从引物3’端开始,将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工:dna聚合酶i将引物切去,并合成空缺处的dna单链,再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来(半不连续合成。先导链,滞后链)子链合成特点:不能从头合成;合成方向为“5’→3’合成”。感悟生命的神秘:dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成,还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次,只有碱基配对无误后才能继续往下聚合,它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能,因此rna的合成不需要引物,而是从头合成的,它的错配可能性较大,在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去,代之以高保真的dna链。[思考]dna分子能准确复制的原因有哪些?dna双螺旋结构提供模板;碱基互补配对;dna聚合酶的复查功能。[思考]细胞内哪些物质是从头合成的?rna合成、蛋白质合成。1.3dna分子复制的人工控制解开螺旋:在80~100℃时,dna双螺旋打开,形成两条dna单链,称为变性。恢复螺旋:在50℃左右时,两条dna单链重新形成双螺旋结构,称为复性。复制条件:缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。反应场所:pcr仪(自动温度周期性调节)。[思考]缓冲液相当细胞内的什么成分?(核基质)4.pcr的反应过程
变性
复性
延伸
变性:在95℃时dna解旋复性:在50℃时引物与dna单链结合延伸:在72℃时合成dna子链(两个引物间的序列)2.实验操作2.1 pcr反应体系:缓冲液、dna模板,四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物,水2.2 实验操作步骤2.3 按照pcr反应体系配方配制反应液;(2)将pcr反应体系50μl用微量移液器转移到微量离心管(0.5ml)中;(3)将微量离心管放到pcr仪中;(4)设置pcr仪的工作参数。(5)dna在pcr仪中大量扩增。2.4 水浴法:将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3.实验注意事项3.1避免外源dna污染:所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。3.2缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。3.3每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。3.4混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。4.结果分析与评价4.1反应液稀释:取2µlpcr反应液,添加98µl蒸馏水;2.分光光度计调零:将100µl蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计调整读数为零。4.2将100µl反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值。4.3计算:dna含量=50×光吸收值×稀释倍数(三)课堂总结、点评